Práctica: Hemoglobina

Materiales:

• Drabkin (Blanco)
• Hemoglobina (Calibrador)
• Sangre (Muestra)
• Pipeta Pasteur
• Pipeta y prepipeta
• Tubos de ensayo
• Cubetas
• Espectofotómetro

Preparación:

Preparamos el reactivo, en este caso el Drabkin.

Para 5 ml = 4.9 ml de agua destilada + 2 gotas de reactivo. Mezclamos muy bien.

Condiciones del ensayo:

Longitud de onda = 540 nm

Temperatura = 15-25ºC.

Procedimiento:

Ajustamos el espectofotómetro a 0 frente a agua destilada.

Pipeteamos:

1º tubo = 5 ml de Drabkin.

2º tubo = 5 ml de Drabkin + 20microlitos de hemoglobina.

3º tubo = 5 ml de Drabkin + 20microlitros de muestra (sangre).

Se mezcla muy bien a temperatura ambiente.

Metemos el Drabkin o ferricianuro a 400nm y hacemos el 0.

A continuación metemos:

3,5ml del 2º tubo a:

440nm = 1.781

Configuramos blanco. (Con el Drabkin siempre en esta práctica).

460nm = 0.836

Configuramos blanco.

480 = 0.525

Configuramos blanco.

500 = 0.407

Configuramos blanco.

520 = 0.487

Configuramos blanco.

530 = 0.588

Configuramos blanco.

540 = 0.628 MÁX.

Configuramos blanco.

550 = 0.607

Configuramos blanco.

560 = 0.533

Configuramos blanco.

580 = 0.372

Configuramos blanco.

600 = 0.180

Leemos la absorbancia:

Ahora cogemos 6 cubetas y diluímos el ferricianuro + hemoglobina.

1ª cubeta: 600 microlitros de ferricianuro + hemoglobina + enrasado con ferricianuro. = 0.116

2º cubeta: 500 microlitros de ferricianuro + hemoglobina + enrasado con ferricianuro. = 0.085

3º cubeta: 400 microlitros de ferricianuro + hemoglobina + enrasado con ferricianuro. = 0.065

4º cubeta: 300 microlitros de ferricianuro + hemoglobina + enrasado con ferricianuro. = 0.071

5º cubeta: 200 microlitros de ferricianuro + hemoglobina + enrasado con ferricianuro. = 0.039

6º cubeta: 100 microlitros de ferricianuro + hemoglobina + enrasado con ferricianuro. = 0.034

Ahora para saber la hemoglobina en sangre ponemos una cubeta con Drabkin + sangre.

540nm = 0.384  

Blanco = 0

Calibrador = 0.628

Muestra = 0.384

Cálculos:

Con patrón:

(A) Muestra / (B) Patrón * 15 (Conc. Patrón) = g/dL de hemoglobina en la muestra.

0.384 / 0.628 * 15 = 9.17

Valores de referencia:

Hombres: 14-18 g/dL = 8.7-11.2 mmol/L

Mujeres: 12-16 g/dL = 7.5-9.9 mmol/L

En este caso la muestra de sangre era de una mujer, observamos que tiene la hemoglobina en sangre baja.

Blanco,reactivo y muestra.

Cubetas diluídas.